一、条形码mRNA平台：从设计到验证的技术突破
传统mRNA筛选技术面临载体与载荷性质不一致的难题，例如基于DNA的筛选方法无法真实反映mRNA在体内的代谢命运。为解决这一痛点，研究团队创新性地提出将条形码直接整合至mRNA分子中，构建了b-mRNA（barcoded mRNA）筛选平台。
1.1 条形码序列的理性设计
研究团队通过计算机算法设计了200个12nt（核苷酸）长度的条形码序列，其核心设计原则包括：
- 纠错能力：采用Hamming距离≥3的编码策略，确保单个碱基突变仍可被正确识别；
- 序列特异性：通过BLAST分析排除与哺乳动物基因组同源的序列，避免脱靶效应；
- GC含量控制：将GC比例维持在40%-60%区间，平衡转录效率与稳定性。
合成后的双链DNA模板经体外转录（IVT）生成结构统一的b-mRNA，其分子架构包含五大功能模块：
5'-Cap1 → 5'UTR → EGFP编码区 → 条形码区 → 3'UTR → poly(A)尾
其中，Cap1结构增强mRNA稳定性，UTR区域优化翻译效率，EGFP作为报告基因实现表达可视化。
1.2 平台性能的三重验证
序列准确性验证：通过Sanger测序确认，200个b-mRNA样本的条形码区域呈现预期多态性，而其他序列区域高度一致，证明合成流程的可靠性。
功能无损性验证：在HeLa细胞模型中，携带条形码的EGFP mRNA与普通EGFP mRNA的转染效率差异小于5%（p>0.05），表明条形码整合未影响mRNA的翻译活性。
偏倚剔除机制：将200种b-mRNA混合包封至同一LNP后注射小鼠，通过NGS分析多组织样本发现：
- 66个序列在特定组织（如肝、脾）中呈现异常富集；
- 进一步分析显示，这些序列与组织特异性miRNA（如miR-122在肝中高表达）存在互补配对，导致mRNA被特异性降解；
- 最终筛选出134个无偏倚序列，构建了适用于高通量筛选的标准化库。
二、肝外靶向LNP的发现：从库构建到机制解析
在建立稳定的b-mRNA平台后，研究团队转向LNP配方的优化，目标是发现能突破肝靶向限制的新型递送载体。
2.1 可离子化脂质库的规模化合成
研究团队构建了包含133种可离子化脂质的LNP库，其设计策略涵盖两大维度：
- 化学多样性：通过“即插即用”模块化合成平台，系统变异脂质头基（如伯胺、仲胺、叔胺）、疏水尾链（C12-C18烷基链）及连接键（酯键、酰胺键、醚键）；
- 生物降解性：引入酯键或碳酸酯键等可水解基团，确保脂质在体内可被代谢清除，降低长期毒性风险；
- 对照设计：纳入DLin-MC3-DMA等金标准脂质作为阳性对照，验证筛选体系的敏感性。
2.2 高通量体内筛选流程
实验设计：
- 将134种b-mRNA分别包封至133种LNP中，通过动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）确认粒径（80-120nm）和PDI（<0.2）符合要求；
- 将122种成功包封的b-mRNA-LNP复合物等量混合，静脉注射至野生型C57BL/6小鼠和ApoE敲除小鼠（后者用于模拟高血脂病理状态）；
- 6小时后采集血液、肺、肝、脾组织，通过流式细胞术分选关键细胞类型（如肝库普弗细胞、肺泡巨噬细胞）；
- 利用NGS定量每个b-mRNA在不同细胞中的积累量，计算“靶向指数”（Targeting Index, TI）：
TI = (组织X中的b-mRNA读数 / 输入剂量) / (肝中的b-mRNA读数 / 输入剂量)
关键发现：
- 在野生型小鼠中，9种LNP配方在肺中的TI值显著高于肝（TI>2，p<0.01）；
- 在ApoE敲除小鼠中，3种配方仍保持肺靶向优势，表明其机制不依赖ApoE介导的内吞途径；
- 结构分析显示，高肺靶向脂质具有以下共性：
- 头基为伯胺结构；
- 疏水尾链长度为C14；
- 连接键为可降解的酯键。
三、技术启示与未来方向
该研究通过整合条形码技术、计算机辅助设计与体内外验证体系，为mRNA-LNP递送系统的优化提供了系统性解决方案。其核心创新点包括：
- 条形码整合策略：直接标记mRNA而非载体，真实反映载荷的体内命运；
- 偏倚剔除机制：通过多组织NGS分析识别并排除干扰序列，提升筛选准确性；
- 病理模型验证：在ApoE敲除小鼠中确认靶向性，增强临床转化相关性。
未来研究可进一步探索：
- 动态追踪技术：结合荧光标记或生物发光成像，实时监测mRNA-LNP在体内的分布与代谢；
- 机器学习辅助设计：利用筛选数据训练模型，预测高靶向性脂质结构；
- 多器官协同递送：开发能同时靶向肝和肺的LNP配方，满足复杂疾病治疗需求。
此项研究不仅为肝外靶向递送提供了创新思路，其构建的高通量筛选平台更可推广至其他组织（如心脏、肌肉）的靶向研究，加速mRNA疗法的临床应用进程。